核酸的提取方法有几种
核酸的提取方法有4种,分别是浓盐法,阴离子去污剂法,苯酚抽提法,水抽提法。
核酸是生物体内的高分子化合物,它包括脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)和核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)两大类。DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的。RNA平均长度大约为2000个核苷酸,而人的DNA却是很长的,约有3X109个核苷酸。
根据核酸在细胞内的分布 存在方式及其特性提取过程中采取了什么相应的措施
在高中阶段只有DNA的粗提取,由于DNA主要存在于细胞核中,所以在提取时如果是植物细胞要研磨,以破坏细胞释放也DNA,动物细胞一般采用加蒸馏水,使其吸水胀破。由于DNA在NaCl中的溶解度不同,调节NaCl的浓度可以使DNA和蛋白质分开。又由于DNA不溶于酒精溶液,而其它一些有机物则可以溶解,在提取时加入酒精,有玻璃棒搅拌就可以提取出DNA来。
核酸提取流程
高中生物必修2中有DNA的粗提取实验,你可以去看看。
DNA:1.实验材料必须准备充足。本实验所用的实验材料是鸡血细胞液,由活鸡的鲜血经沉淀后获得。每组(2个学生)需用5 mL 鸡血细胞液,则每班(50人)至少需要130 mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390 mL 鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的活鸡,一般可得120 mL 左右的鲜血,因此,1个班实验需要买4只活鸡。如果不具备购买活鸡的条件,也可以到市场售活鸡处去索取鸡血,但所带烧杯中必须提前放入抗凝剂。
2.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程中DNA的损失。
3.获取较纯净的DNA的关键步骤。
(1)充分搅拌鸡血细胞液DNA存在于鸡血细胞的细胞核中。将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后,必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂,并释放出DNA。
(2)沉淀DNA时必须用冷酒精实验前必须准备好大量的体积分数为95%的酒精,并在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h。
(3)正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌。教师应提醒学生注意,在进行步骤3、5时,玻璃棒不要直插烧杯底部,而且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA分子。进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动510 min。
RNA:酵母RNA的提制(浓盐法)
一、目的
学习和掌握从酵母中提制RNA的原理和方法,以加深对核酸性质的认识。
二、原理
酵母含 RNA 2.67%~10.0%,DNA很少(0.03%~0.516%),而且菌体容易收集,RNA也易于分离,所以选用酵母为实验材料。
RNA提制过程是先使RNA从细胞中释放,并使它和蛋白质分离,然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质,将pH调至2.0~2.5,使RNA沉淀,进行离心收集。
提取RNA的方法很多,在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者利用稀碱溶解细胞壁,使RNA释放出来,这种方法提取时间短,但RNA在此条件下不稳定,容易分解;后者在加热的条件下,利用高浓度的盐改变细胞膜的透性,使RNA释放出来,此法易掌握,产品颜色较好。
三、仪器、试剂和材料
1.仪器
(1)量筒(50ml)
(2)三角瓶(100ml)
(3)烧杯(250ml,50ml,10ml)
(4)布氏漏斗(40mm)
(5)吸滤瓶(125ml)
(6)表面皿(6cm)
(7)751型分光光度计
(8)离心机(4000r/min)
(9)恒温水浴
(10)药物天平
(11)烘箱
2.试剂
(l)NaCl(化学纯)
(2)6mol/L HCI
(3)95%乙醇(化学纯)
3.材料
鲜酵母或干酵母;pHO.5~5.0的精密试纸。
四、操作步骤
1.提取
称取鲜酵母 159或干酵母粉 2.5g,倒入 100ml三角瓶中,加 NaCl 2.5g,水25ml,搅拌均匀,置于沸水浴中提取lh。
2.分离
将上述提取液用自来水冷却后,装入大离心管内,以4000r/min离心10min,使提取液与菌体残渣等分离。
3.沉淀RNA
将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内,并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却.待冷至10℃以下时,用6mol/L HCI 小心地调节pH值至2.0~2.5(注意严格控制pH)。调好后继续于冰水中静置10min,使沉淀充分,颗粒变大。
4.洗涤和抽滤
上述悬浮液以 4000r/min离心 10min,得到 RNA沉淀。将沉淀物放在 10ml小烧杯内,用95%的乙醇 5~10ml充分搅拌洗涤,然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤,再用 95%乙醇5~10ml淋洗 3次。
5.干燥
从布氏漏斗上取下沉淀物,放在6cm表面皿上,铺成薄层,置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA制品称重,存放于干燥器内。
6.含量测定
将干燥后RNA产品配制成浓度为 10—50pg/ml的溶液,在751型分光光度
计上测定其260nm处的吸光度,按下式计算RNA含量:
式中,A260为260nm处的吸光度;L为比色杯光径(cm);0.024为lml溶液含lμg
RNA的吸光度。
五、结果处理
根据含量测定的结果按下式计算提取率
六、注意事项
1.用浓盐法提取RNA时应注意掌握温度,避免在20~27℃之间停留时间过长,因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围,会使RNA降解而降低提取率。
2.加热至90~100℃使蛋白质变性,破坏两类磷酸酯酶,有利于RNA的提取。
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